组建cDNA文库的组建有哪些步骤?
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发布时间：2022-04-24 01:09
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时间：2023-09-18 14:46
（1）制备mRNA：通常mRNA约占总RNA的1%5%，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获取胰岛素基因，应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料。
将提取的总RNA在寡聚脱氧核苷酸[oligo（dT）]纤维素中进行亲和层析，分离获得mRNA。
（2）cDNA第一链的合成：所有cDNA第一链的合成方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应。与cDNA第一链合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3′端poly（A）互补的1218个核苷酸长的oligo（dT），沿模板的3′→5′方向合成，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA。
（3）cDNA第二链的合成：通常有自身引导合成法和置换合成法两种方法合成。自身引导合成法。用碱处理mRNA-cDNA杂交体，水解mRNA模板，cDNA第一链3′端能够形成发夹结构，这种结构可用作合成cDNA第二链的引物。在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段或反转录酶的作用下，以四种dNTP为原料完成双链cDNA的合成，利用这种方法合成的双链DNA产物，在其末端相应于mRNA：5′端的位置借一发夹结构闭合成环，再用单链特异性的S1核酸酶消化此环，得到双链cDNA分子，方可经适当的方法克隆到载体中。置换合成法。这是以cDNA第一链的合成产物mRNA-cDNA杂交体为模板，利用RNA酶H和DNA聚合酶I共同催化的切口平移反应，合成cDNA第二链的方法。
RNA酶H在杂交体中的mRNA链上造成切口或缺口，emphasis：role=italicE：coli：emphasisDNA聚合酶I以RN*段为引物，合成DNA链，取代模板上的mRNA；这些DN*段经T4噬菌体DNA连接酶连接，形成完整的cDNA第二链。这种方法最大的优点是可以获得十分接近全长的双链cDNA产物，另外还有直接利用第一链的反应产物、无须处理和纯化以及很高效率的特点。
（4）cDNA与载体连接和导入宿主细胞：cDN*段与载体DNA的连接就是在一定的条件下，由DNA连接酶催化两个双链DN*段相邻的5′-P与3′-OH之间形成磷酸二酯键的过程。由于T4：DNA连接酶的底物范围广，尤其是能有效地连接DNA的平末端，故其应用最广泛。连接后将靶DNA通过适当方法导入受体细胞，使其进行大量复制、增殖和表达，从而获取大量的克隆基因。
