凝胶过滤层析中线性和球状的区别
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发布时间：2022-12-26 19:30
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热心网友
时间：2023-10-16 22:06
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(4)凝胶过滤常用填料种类目前常用的凝胶包括3个主要类型:A:葡聚糖凝胶(Polydextran)，商品名称是SephadexPolydextran几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex G-X，X表示葡聚糖的交联程度，数值越大则交联度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。 Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关，大概范围如下:型号粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质)G 1055,166<700G 1560-180<1500G 25-1000-5000G 50-1500-30000G 75-3000-80000G 100-4000-150000G 150-5000-300000 G 200-5000-600000Superdex属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶，流速快、反压低。型号粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质) Superdex 30 24-44<10000Superdex 75 24-443000-70000Superdex 200 10000-600000B 聚丙稀酰胺凝胶(Polyacrylamide)Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状。依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH值应尽量控制在2-10之间。型号粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质) Bio-Gel P-2 -
<1800Bio-Gel P-4 -800-4000Bio-Gel P-6 -1000-6000Bio-Gel P-10 -1500-20000Bio-Gel P-30 -2500-40000Bio-Gel P-60 -3000-60000C 琼脂糖凝胶商品名称Sepharose，由属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。经2，3,二溴丙醇反应交联而成的凝胶为Sepharose CL型凝胶型号粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质) Sepharose 2B 70000,40000000Sepharose 4B 60000,20000000Sepharose 6B4000000 10000,Sepharose CL-2B 70000,40000000Sepharose CL-4B 60000,20000000Sepharose CL-6B10000,4000000Superpose琼脂糖经多次交联形成的凝胶。型号粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质) Superose 65000,5000000Superose 121000,300000其它凝胶:聚丙稀酰胺葡聚糖凝胶，交联聚苯乙烯凝胶，聚乙烯醇凝胶等，还有更多新型号的凝胶。4 操作实例(转载)1) 凝胶溶胀凝胶颗粒要求大小比较均匀，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同)，或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。
4 操作实例(转载)1) 凝胶溶胀凝胶颗粒要求大小比较均匀，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同)，或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。 2)装柱与平衡装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。3)上样与洗脱样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1,2mm时，关闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面，应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当样品渗入床中接近床表面1mm时关闭出口。按加样操作，用少量(约1ml)洗脱液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面3,5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的1-2%;制备用量为柱床容积的20%~30%。4)收集与鉴定用自动部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。
5)凝胶柱的处理凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥状态保存。计算分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质量。注意事项各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。蛋白质凝胶过滤层析动画,原创版该动画由生化工程国家重点实验室和国家生化工程技术研究中心(北京)提供，引用请注明出处:凝胶渗透色谱(GPC/SEC)技术一、 凝胶渗透色谱的概述1. 凝胶渗透色谱的简单回顾凝胶渗透色谱[GPC(Gel Permeation Chromatography)][也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)]是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。利用多孔性物质按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。Mc Bain用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953年Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。1959年Porath和Flodin用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高
灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。凝胶渗透色谱的应用 2.三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。尤其是随着新型柱填料的诞生、高效填充柱的出现(目前其理论塔板数已超过10000/米)以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。例如:常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型;相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。另外，除了快速测定分子量及其分布以外，凝胶渗透色谱还广泛用于研究高聚物的支化度，共聚物的组成分布及高聚物中微量添加剂的分析等方面。如果配以在线的绝对分子量检测器(如:LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等)，凝胶渗透色谱可以测定高聚物的绝对分子量。凝胶渗透色谱作为一门新兴的科学，随着各种新型检测器的出现(如UV、FT-IR、LS、Viscometer等)，它的应用范围也逐步从生物化学、高分子化学、无机化学等向其它领域渗透，成为化学领域内必不可少的分析手段。二、 凝胶渗透色谱的基本概念1. 凝胶渗透色谱的分离机理目前关于凝胶渗透色谱的分离机理存在着以下几种基本理论:1.立体排斥理论;2.有限扩散理论;3.流动分离理论。除上述理论外，尚有分子热力学理论和二次排斥理论等。由于应用立体排斥理论解释凝胶渗透色谱中的各种分离现象与事实比较一致，因此立体排斥理论已为人们普遍采用。即:它的分离基础主要依据溶液中分子体积(流体力学体积)的大小来进行分离。 凝胶渗透色谱的分离过程是在装有多孔物质为填料的色谱柱中进行的，一个填料的颗料含有许多不同尺寸的小孔(这些小孔具有一定的分布)，这些小孔对于溶剂分子来说是很大的，它们可以自由地扩散出入。由于高聚物在溶液中以无规线团的形式存在，且高分子线团也具有一定的尺寸，当填料上的孔洞尺寸与高分子线团的尺寸相当时，高分子线团就向孔洞内部扩散。显然，尺寸大的高聚物分子，由于只能扩散到尺寸大的孔洞中，在色谱柱中保留的时间就短;而尺寸小的高聚物分子，几乎能够扩散到填料的所有的孔洞中，向孔内扩散的较深，在色谱柱中保留的时间就长。因此，不同分子量的高聚物分子就按分子量从大到小的次序随着淋洗液的流出而得到分离。图1
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凝胶过滤层析技术原理讲解
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凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)
原创作者;gfzhang
凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称
尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)
凝胶渗透层析(Gel Permeation
