亚克隆实验报告结果分析怎么写
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发布时间：2022-12-24 08:48
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时间：2023-10-08 22:13
1、LB培养基5ml；
2、抗生素：1000X，即1:1000比例。种类根据细菌抗性决定；
3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；
4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA
1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；
2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。取三次；
3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；
4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH） 200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；
5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；
*备注：S1：S2：S3=5:5:7
6、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；
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7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；
8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。重复一遍；
9、空管离心12000xg，1min；
10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）
三、酶切体系
EcoRⅠ
1ul
如需要6管，则先统一配7管的量，再分别加入
酶的总量不宜超过总体系的10%，以防星活性的发生
BamHⅠ
1ul
Buffer EcoRⅠ
5ul
以此定体系，稀释成1X的就好
BSA
0.5ul
使其终浓度为100ug/ul（1X）
去离子水
30.5ul
定容至Buffer EcoRⅠ1X的量
Plasmid
12ul
量要足够
Sum
50ul
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37°两小时以上即可
四、跑胶回收：sost回收失败
1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法
大块胶60ml；小块胶25ml；
需要配置大块胶、大孔胶；
Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；
趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；
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倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。所以大槽25cm，150v即可。小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；
4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；
5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；
6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul
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的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；
7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；
8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；
9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；
10、空离心2min，弃废液；
11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；
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12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；
五、连接体系：
pLXSN Amp+
1
3
5
pLXSN Amp+
S100P
NOG
DKK
对照
Insert
7ul
3ul
7ul
0ul
Vector—pLXSN
1ul
1ul
1ul
1ul
T4连接酶
1ul
1ul
1ul
1ul
Buffer
1ul
1ul
1ul
1ul
去离子水
0ul
4ul
0ul
7ul
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pLRES2 Kana+
2
4
6
pLRES2 Kana+
S100P
NOG
DKK
对照
Insert
7ul
3ul
7ul
0ul
Vector—pLRES2
1ul
1ul
1ul
1ul
T4连接酶
1ul
1ul
1ul
1ul
Buffer
1ul
1ul
1ul
1ul
去离子水
0ul
4ul
0ul
7ul
16℃ 过夜
六、转化
1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；
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2、激活：42℃，90s，不能震动；
3、加500ul LB培养基；
4、37℃，150转摇床，45min；
5、铺板子
七、检测
1、细菌长势良好，对照组不长；
2、酶切检测：
（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；
（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）
5.5ul water
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1ul上游引物
1ul下游引物
（3）用*头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；
（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；
（5）15ul Pcr调节：
360酶
Promega酶
步骤
温度℃
时间
步骤
温度
时间
1
94
0:02:00
1
95
0:02:00
2
94
0:00:30
2
95
0:00:30
3
60（可调节）
0:00:30
3
60
0:00:30
4
72
0:00:45
4
72
0:00:45
5
GOTO
2 REP 34
5
GOTO
2 REP 34
6
72
0:10:00
6
72
0:10:00
7
HOLD 4.0°
ENTER
7
HOLD 4.0°
ENTER
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显示4°/4°时，结束。
（6）Pcr显示有结果，则将相对应的1ml LB体系扩增，见步骤一、扩增；
（7）重复步骤二、纯化质粒DNA；三、酶切体系；四、跑胶但不回收；
（8）有结果则证明之前的酶切、连接、转化成功。
