水稻原生质体转化怎么提取蛋白质
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发布时间：2023-04-15 02:35
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时间：2023-10-14 00:43
水稻原生质体分离及转化水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液*、5 mL*头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。溶液的配制：母液的配制：1、0.2 M MES(pH 5.7)2、0.8 M Mannitol(甘露醇)3、1 M CaCl24、2 M KCl5、2 M MgCl26、10% BSA[Fluka PEG 4000 81240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20 mL ×2MES 0.5mL 1 mLMannitol 7.5mL 15 mLCellucose（纤维素酶）0.15g 0.3 gMacerozyme（离析酶）0.075g 0.15 gddH2O 1.8mL 3.6 mL55℃10 min冷却至RT后加入200 uL CaCl2加入200 uL 10% BSAMmg: 20 mL ×2 MES 0.2mL 0.4 mLMannitol 5mL 10 mLMgCl2 0.075mL 0.15 mLddH2O 4.725mL 9.45 mLPEG-CaCl2: 20 mL ×2Mannitol 2.5mL 5 mLCaCl2 1mL 2 mLPEG4000 4g 8 gddH2O 3mL 6 mLW5: 200 mLMES 2 mLNaCl 1.8 gCaCl2?2H2O 3.67525 gKCl 0.5 mLddH2O 197.5 mL具体实验步骤：1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。
3、将酶解液（约20 mL）倒入100 mL锥形瓶中，然后轻轻地将细碎的幼苗倒入锥形瓶中（注意不要撒到锥形瓶壁上），然后轻轻地摇晃，使其均匀分散。4、黑暗条件下（用不透光的黑色塑料袋包裹即可，下同）置于摇床中（60 rpm/ min）摇晃5 h，使细胞充分酶解。此时也可以将PEG-CaCl2溶液一同置于摇
