免疫组化的操作步骤

发布网友发布时间：2022-04-22 07:20

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热心网友时间：2022-06-17 14:09

一免疫组化（SP法）操作步骤
1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行
2.缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）
6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）
8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer（酶标二抗），在室温下孵育 30 分钟。
（注：HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）
12 ．缓冲液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）
14 ．自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。 ⑴、石蜡切片脱蜡至水。
⑵、 3%H 2 O2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
⑶、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。
⑸、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑹、滴加适量生物素标记二抗工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
⑺、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑻、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
⑼、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑽、显色剂显色 3-15 分钟（DAB 或 NBT/BCIP）
⑾、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。冰冻切片 4-8μm ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

热心网友时间：2022-06-17 14:10

1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2.缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

(注:孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清，这一步可以省略。)

6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)

8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增强子)，在室温下孵育 20 分钟。

10 .缓冲液洗 5min/2 次。

11 .滴加 HRP Polymer(酶标二抗) ，在室温下孵育 30 分钟。

(注:HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)

12 .缓冲液洗 5min/2 次。

13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen)，混匀后滴加到切片上，孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)

14 .自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

简介：

免疫组化，是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

基本原理：

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

热心网友时间：2022-06-17 14:10

免疫组化操作步骤

一免疫组化（ LP 法）操作步骤：

1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2. 缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）

6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）

8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。

10 ．缓冲液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。

（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）

12 ．缓冲液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）

14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。

二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：

（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。

（ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

（ 6 ）、滴加适量生物素标记二抗工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。

（ 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

（ 8 ）、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。

（ 9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

（ 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ）

（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

三. 冰冻切片免疫组化染色步骤：

冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。以下同石蜡切片免疫组化