分离出细胞内溶酶体的方法

发布网友发布时间：2022-10-24 13:11

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热心网友时间：2023-10-25 17:01

溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器，含有高浓度的各种水解酶类，用于细胞内的消化过程。它被一层单位膜单独包围，含有12种以上的酶，其中包括蛋白酶、核酸降解酶和糖苷酶。
它们都是消化酶，能分解细胞内的物质，如蛋白质、核酸、多糖类。这种消化酶与细胞内含物的其它部分严格的分开，否则它们将进行自身消化，因此又有“自杀袋”自称。
现在认为溶酶体与卵的受精、形态发生、衰老及某些疾病有关，其分离纯化方法可用分级离心，再用等密度蔗糖梯度离心纯化，也可用Triton-WR1339处理大鼠，2~4h后杀死，毒性低，比重小的Triton-WR1339集中在溶酶体上，使溶酶体比重便轻，易于分离。
操作方法：
所有操作需在4℃下进行。
1．制备蔗糖梯度溶液：取带有两个连同小杯的梯度混合器，两个小杯分别装入117ml 2.1mol/L蔗糖和13ml 1.1mol/L的蔗糖。
2．将大鼠处死取出肾脏，以1:8（重量/体积）比例加入0.3mol/L蔗糖，然后在玻璃匀浆器中匀浆肾脏组织。
3．以150g ×10min离心，弃沉淀，取上清液9,000g×3min离心，弃上清液，取沉淀。
4．沉淀从上至下依次为白色、黄褐色、暗褐色三种不同颜色层，上层为膜成分的混合物，中层为线立体部分，最底层则为半纯化的溶酶体。先用吸管小心吸掉上层，然后沿管壁加入几毫升0.3mol/L蔗糖，慢慢摇管使界面层悬浮起来弃之。用0.3mol/L蔗糖洗涤1次，底层溶酶体部分悬浮在2.5ml 0.3mol/L蔗糖中。
5．将2ml悬浮的半纯化的溶酶体铺在蔗糖梯度上面，用玻璃棒搅动最上层的梯度，使梯度和溶酶体之间的界面破坏，然后100,000g×150min离心，离心结果可见：梯度溶液分3条明显的带和较少的沉淀。最下层的暗*到褐色的带即为纯化的溶酶体。