SSH的操作有哪些方法?
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发布时间：2022-10-21 13:31
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时间：2024-09-30 14:39
（1）cDNA的消化：首先将由mRNA逆转录来的检测子cDNA（tester）和驱动子cDNA（driver）分别用同一种识别四碱基序列的*性内切酶emphasis：role=italicRsaemphasisI消化形成平均长度大于500bp的cDN*段，这样可增加有差别表达基因检出的可能性，以防止长链片段形成的复杂结构对消减杂交的干扰。
（2）连接接头（adaptor）：将tester：cDNA均分为两份，分别接上接头adaptor：1和adaptor：2。接头的设计十分巧妙，它是一个由长链（40nt）和一个短链（10nt）组成的一端是平端的双链DN*段，且双链5′端均无磷酸化基团，保证了接头以惟一方向与cDN*段连接，接头外侧序列与第一次PCR引物序列相同，而内侧序列则与第二次PCR（巢式PCR）引物序列相同，有利于后续PCR的筛选扩增。此外接头上含有T7动子序列及内切酶识别位点，为以后克隆和测序提供方便。
（3）两轮消减杂交：用过量Driver：cDNA样品与上述两份连有接头的Tester：cDNA样品进行第一次消减杂交，分别得到4种产物，这种不充分杂交使得单链cDNA分子在浓度上基本相同。同时由于Tester：cDNA与Driver：cDNA序列中相同片段大都形成异源双链分子，使得Tester：cDNA中差异表达基因得到第一次富集；然后混合上述两份杂交样品，同时加入新的变性Driver：cDNA进行第二次消减杂交，此次杂交只有第一次杂交后经扣除和丰度均等化的单链Tester：cDNA能与Driver：cDNA形成双链分子，这一次杂交进一步富集了差异表达的cDNA，并且还形成了2个5′端分别接不同接头的双链分子。
（4）两次PCR反应：5′端填平末端，加入根据接头设计的引物进行两次PCR。第一次PCR基于抑制反应，只有两端连接有2个不同接头的双链cDN*段才能得到指数扩增。第二次PCR实际上是巢式PCR，极大地提高了扩增特异性，使差异表达的目的基因片段得到大量富集，然后利用接头上存在的酶切位点，插入适当载体，转化细菌，初步筛选出具有插入的克隆，再经杂交筛出具有差异表达的克隆，进行测序、同源分析等系列工作，最后完成全长基因的克隆、鉴定。
