甘油酯酰转移酶在哪种细胞器中?
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发布时间：2022-04-23 02:57
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时间：2023-06-22 13:52
在植物中，三酰甘油（TAG）主要储藏在种子、果实、花瓣和雄蕊的花粉囊等组织中。TAG作为最主要的储藏脂类，是食用花生油的主要成分，它在花生籽粒中大量合成。TAG的合成途径称为Kennedy途径（Kennedy l961），二酰甘油乙酰转移酶（DGAT）催化的由二酰甘油（DAG）合成TAG是该途径的最后一步，也是该途径的限速步骤，因此DGAT成为该代谢途径中最关键的酶。
（1）DGAT是一个内质网结合蛋白，其活性主要位于内质网
Settlage等通过分离大豆油脂体和内质网（ER）发现，DGAT活性与可作为ER标记的细胞色素c还原酶高度一致（settlage et al. 1995）。Bouvier-Nave等将拟南芥DGAT基因在酵母中过表达，通过100000g超速离心分离酵母细胞膜蛋白系统，发现其具有很高的DGAT酶活性，而在作为对照的酵母细胞膜系统中没有发现这种高活性（Bouvier-Naveetal. 2000）。
（2）DGAT催化Kennedy中唯一的限速步骤
二酰甘油（DAG）处于磷脂和储藏脂质的分支处，DGAT催化Kennedy途径上最后一步的乙酰化反应，它的主要作用机制是使二酰甘油加上脂肪酸酰基形成三酰甘油（TAG），是三酰甘油合成的限速酶。研究黑暗/光处理的植物发现，在脂类累计的高峰期，DGAT是参与Kennedy途径的四个酶中活性最低的一个（Perry et al., 1999）。因此DGAT 极可能成为该代谢途径中最关键的酶，很多研究结果证实了这一推断。通过研究低含油和高含油量的大豆发现，DGAT的活性高低同大豆含油量、油脂积累速率呈正相关（Settlage et al. 1998; Perry and Harwood 1993）。拟南芥突变体As11是位于Ⅱ号染色体的一个长度为147 bp的DNA插入突变体，它使Tag1 cDNA中81 bp长的第二个外显子发生重复，此突变体中种子的脂肪酸含量降低，发育迟缓。研究发现，在突变体AS11中DGAT的酶活性明显降低（Zou et al. 1999）。通过构建野生型Tag1基因cDNA单拷贝表达载体对As11进行基因互补研究，发现能够减少AS11中脂肪酸含量的降低。通过对AtDGAT基因在野生型拟南芥中过表达研究发现，它使拟南芥种子的油含量、大小都明显增加，并且这种增加是和DGAT基因的转录水平相一致的。DGAT的酶活性在转基因株系中增加了10到70% （Jako et al. 200l）。
（3）DGAT基因的克隆和功能分析
1998年Cases等根据胆固醇乙酰转移酶（ACAT）的序列得到两个高同源性的老鼠EST克隆，从而克隆了第一个DGAT基因，该基因同老鼠ACAT具有20%的一致性。将其在昆虫细胞中表达，发现它并不具有ACAT的酶活性。当用14C标记的乙酰CoA为底物时，发现在一系列的受体中只有DAG是合适的受体分子，从而发现它具有乙酰转移酶的活性（Cases et al. 1998）。随后，Hobbs等根据老鼠DGAT基因序列从拟南芥中克隆得到AtDGAT基因，它编码520个氨基酸，和老鼠DGAT的氨基酸序列有38%同源性。在昆虫细胞中表达该基因证实了它的乙酰转移酶活性。Southern分析发现AtDGAT在拟南芥基因组中只有一个拷贝存在（Hobbs et al. 1999）。Nykiforuk 等从油菜中克隆了BnDGAT，它与AtDGAT和老鼠DGAT在蛋白水平上分别表现出90%及57%的相似性，(Nykiforuk et al. 1999)。He 等从蓖麻种子cDNA中克隆得到RcDGAT基因，Southem分析发现在基因组中只存在一个拷贝。通过在酿酒酵母中过表达RcDGAT 研究了它的乙酰转移酶活性（He et al. 2004）。Bouvier-Nave等从烟草中克隆NtDGAT，在酵母中过表达后使酵母中DGAT活性提高了2-3倍（Bouvier-Nave et al. 2000）。此外还在橄榄（Giannoulia and Hatzopoulos 2003）、番茄、紫苏、金莲花等中克隆了DGAT基因。
最近，美国先锋公司的Zheng等（2008）采用图位克隆的方法从高油玉米中克隆了一个控制玉米种子油份含量和油酸含量的主效QTL，经分析该QTL为DGAT编码基因。通过比较高油和普通玉米中该基因的氨基酸序列，共发现4处氨基酸差异，其中N端3处（V45G、P55S和Q67缺失），靠近C端1处（F469插入）。Zheng等利用SNP标记分析了4000株BC5S1群体，发现QTL位于DGAT基因的3’端，而3’端的唯一差异是苯丙氨酸的插入，因此推测该苯丙氨酸的插入对高油玉米油份含量和油酸含量的提高起重要作用。随后，他们利用转基因的方法发现表达普通玉米DGAT基因的转基因玉米种子含油量，胚含油量和油酸含量提高了9.3%、12.4%和40.5%，而表达高油玉米DGAT基因转基因植株种子含油量，胚含油量和油酸含量提高27.9%、26.1%和84.5%，因而证实苯丙氨酸的插入对高油玉米油份含量和油酸含量的提高起重要作用。序列分析发现，苯丙氨酸插入的469位置为跨膜螺旋区域。普通玉米中该氨基酸的缺失，将会改变跨膜螺旋残基的侧链位置，进而影响蛋白结构和蛋白活性。
Wang 等（2006）以AtDGAT序列为参照筛选大豆EST数据库，通过同源克隆和RACE方法克隆得到大豆GmDGAT，该基因同百脉根（Lotus corniculatus）的LcDGAT表现出78.2%的相似性。另外，GmDGAT等位基因也被从13个大豆种质中分离得到，包括6个栽培大豆，5个soja亚属野生大豆，1个latifilia亚属野生大豆（PW0031）和1个tomentella亚属野生大豆（PW0063）种质。通过对其氨基酸序列的比较，发现大豆DGAT氨基酸序列在N端存在4处较大的氨基酸缺失差异。第一处差异位于第26个氨基酸的位置，两个野生大豆PW0031和PW0063在这里具有Thr-Ser-Ala的氨基酸序列，而12个属于soja亚属的大豆却在此处缺失了该3个氨基酸；第二个差异发生在第58个氨基酸处，在所有属于soja亚属的大豆中都缺失了2个氨基酸；第三个差异位于第63个氨基酸处，此处所有soja亚属的大豆和PW0031中都缺失一个N氨基酸；最后一个差异出现在第101个氨基酸处，14个大豆种质中有11个缺失Gln-Leu的氨基酸，而3个大豆种质（Dian YD028、Wandou16和PW0031）却具有此两个氨基酸。在C端，14个大豆种质中只发现5个单氨基酸的差异，其中2个单氨基酸的变化是同义的。位于第371氨基酸除的差异引人注意，两种野生大豆PW0063和PW0031在此位置都是Lys，其他12个大豆种质在此处却是Gln（此处恰好存在一个跨膜结构域），而百脉根、蓖麻、油菜、烟草、橄榄、拟南芥和水稻此处也是Lys，表明此处的Gln是G.max和G. soja的大豆种质特有的。这些结果对于阐明大豆亚属间遗传多样性有重要意义，对于研究其他植物类群遗传多样性方面也将提供重要的启示。
花生AhDGAT（Saha et al. 2006）是从花生未成熟种子的胞质中克隆到，它的mRNA只在未成熟种子被检测到。在胚发育过程中，AhDGAT蛋白在开花8天后可检测到；在15-24天急剧增多；然后在成熟种子中慢慢降低。在大肠杆菌中表达此基因发现，AhDGAT只对1，2酰甘油二酯起作用，并且，在所利用的底物中，相对于棕榈酰和硬脂酰，油酰辅酶A是首选的酰基供体。这一途径为提高油料作物油产量和改善油料作物脂肪组分方面可能提供帮助。
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