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细胞爬片免疫荧光实验具体操作步骤是什么

发布网友 发布时间:2022-10-05 05:43

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热心网友 时间:2023-10-17 08:30

1.晶安生物细胞爬片;首先是玻片的处理,普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块,先用洗衣粉洗干净,用水冲静烤干,然后泡酸过夜,捞酸后流水洗净,烤干,置于器皿中高压灭菌,然后再烤箱中大约8小时烤干备用。爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可,我选择在培养皿中爬。一为节约经费(培养皿可以重复利用)二来觉得培养皿口大,操作比较方便。培养皿消毒同上,消毒时记得消两把镊子具体操作是:用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成单细胞悬液(注意:这一点很重要,关系到将来爬出来片子的质量)取出消毒的培养皿,可以先加少量培养基(以使玻片与培养皿紧密接触),将玻片小心放入摆放其中,然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5%CO2的暖箱中培养,根据细胞生长状况,24小时或更长时间适时取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒钟,然后在4%多聚甲醛中固定15分钟,然后再用37度去离子水将甲醛冲干净,注意手法轻柔,要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干,然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验,要不然玻片会掉下来的,就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在-20保存备用,具体能保存多长时间不太清楚,当然尽量早用。 2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮); 3.PBS漂洗5min; 4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理); 5.PBS漂洗2次,每次5min; 6.1%BSA封闭30min; 7.加入1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2h; 8.PBS漂洗2次,每次5min; 9.加入1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1h; 10.PBS漂洗2次,每次5min; 11.5ug/ml DAPI染色2min; 12.抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂: 2.5% DABCO (w) 50mM Tris(pH8.0) 90%甘油
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