一种实用的研究分子间体内互作实验方法-ChIRP
发布网友
发布时间：2022-11-30 18:40
共1个回答
热心网友
时间：2023-11-27 03:02
（1 ）、ChRIP 实验可研究细胞体内互作；
（2 ）、ChRIP 实验既同时可研究RNA 、蛋白质和DNA 形成的复合体之间的互作；也可研究它们之间的两两互作；
（3 ）、利用ChRIP-MS 实验寻找与目的lncRNA 结合的蛋白，可不受lncRNA 长度的*；
（4 ）、利用ChRIP 实验可研究circRNA 与蛋白质或DNA 之间的互作。
技术流程
（1）、ChRIP-RNA：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→RNA回收与纯化→NGS或qRT-PCR检测；
（2）、ChRIP-DNA：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→DNA回收与纯化→NGS或qPCR检测；
（3）、ChRIP-Protein：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→蛋白分离→质谱鉴定。
ChIRP实验标准实验分组如下 ：
（1）、IP组：目标lncRNA/circRNA Odd组和Even组（即实验组，用于鉴定lncRNA/circRNA作用基因组位置）
（2）、lacZ组：外参对照组，证明ChIRP探针的特异性；
（3）、Input组：捕获前分离提取的基因组DNA，作为内参对照组，证明探针特异性；
（4）、Positive组：阳性对照组，通过已知验证有效的探针，通过WB检测已知结合蛋白质，证明整个ChIRP实验体系的有效性；
（5）、目标lncRNA/circRNAqPCR：证明ChIRP探针对目标lncRNA的正确结合及有效捕获。
案例分析
案列1 ：ChRIP-protein 研究
结果解析 ：图A展示的整个ChIRP-WB或ChIRP-MS实验大致的实验流程；图B阐述的是ChIRP实验中U1探针和U2探针富集到的RNA长度分布，结果显示，input组的RNA大小为150-4000nt不等，而U1探针和U2探针富集的RNA长度为150-200nt，说明U1探针和U2探针能有效地富集样本中的U1和U2；图C是U1、U2、U3的ChIRP-WB实验结果，实验结果证明，U1和U2可与U1A蛋白结合，U3可与FIBRILLARIN蛋白结合。
案列2：ChRIP-DNA研究
结果解析 ： 图A展示的是通过生物信息学分析，预测出lncRNA FOXD2-AS1与TRIB3 Promoter的三个结合位点；图B是lncRNA FOXD2-AS1在UM-UC-3细胞中进行ChIRP-qPCR实验结果；图C是ChIRP实验中lncRNA FOXD2-AS1的奇数探针和偶素探针的富集效率检测结果。综合实验结果表明，lncRNA FOXD2-AS1可与TRIB3 Promoter结合，且结合位点位于预测位点的P3位点。
案列3 ：ChRIP-circRNA-protein 研究
结果解析 ：图a展示的是图b、c、d实验的简单实验流程图；图b是利用circRNA探针进行的类似ChIRP实验原理的RNApulldown结果；图c是对图a的circRNA-RNA pulldown产物进行qPCR的实验结果；图d是利用circRNA探针进行ChIRP-qPCR实验结果。综合实验结果表明，circEIF3J和circPAIP2能与RNA聚合酶复合体结合，也能与本身目基因启动子结合从而*母基因的表达水平。
案列4 ：ChRIP-circRNA-miR 研究
结果解析 ：图A展示的是circPVT1与microRNA结合位点的预测结果；图B是类似ChIRP实验原理的circRNApulldown原理图；图C是对circRNA-RNA pulldown产物进行circPVT1的qPCR的实验结果，该结果反映的是circPVT1探针的有效性；图D是circRNA-RNA pulldown产物进行microRNA qPCR检测的实验结果。综合实验结果表明，circPVT1能与has-let-7有效结合，从而达到富集细胞内的游离的has-let-7，进而间接*has-let-7的下游靶基因。
样本要求：
细胞数量：细胞数量需要达到108个；提供活细胞样本。
实验周期：
50个工作日。
其他注意事项：
1、目标lncRNA/circRNA的表达丰度：
2、如果目标lncRNA/circRNA表达丰度较低，需要进行过表达以确保ChIRP成功；
