新鲜细胞和冻存的细胞提取蛋白有区别么

发布网友发布时间：2022-04-22 09:10

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热心网友时间：2023-04-22 16:04

一、材料
　　（一）仪器
　　1.
净化工作台
　　2.
离心机
　　3.
恒温水浴箱
　　4.
冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
　　5.
倒置相差显微镜
　　6.
培养箱
　　7.
液氮冰箱
　　（二）玻璃器皿
　　1.
吸管（弯头、直头）
　　2.
培养瓶
　　3.
玻璃瓶（250ml、100ml）
　　4.
废液缸
　　（三）塑料器皿
　　1.
吸头
　　2.
*头
　　3.
胶塞
　　4.
移液管（10ml）
　　5.
15ml离心管
　　6.
冻存管（1～2ml）
　　（四）其他物品
　　1.
微量加样*
　　2.
红血球计数板
　　3.
记号笔
　　4.
医用橡皮膏
　　5.
移液*
　　（五）试剂
　　1.
d-hanks液
　　2.
小牛血清
　　3.
培养液
　　4.
双抗（青霉素、链霉素）
　　5.
胰蛋白酶（0.08%）
　　6.
1nhcl
　　7.
7.4%nahco3
　　8.
dmso（分析纯）或无色新鲜甘油
二、操作步骤
　　（一）细胞冻存
　　1.
配制含10%dmso或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
　　2.
取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
　　3.
离心1000rpm，5min；
　　4.
去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
　　5.
将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5
ml；
　　6.
在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
　　7.
冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/
min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/
　　min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h
，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
　　（二）
细胞复苏
　　1.
从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
　　2.
从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
　　3.
离心，
1000rpm，5min；
　　4.
弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
　　5.
次日更换一次培养液，继续培养。
三、注意事项
　　1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
　　2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
　　3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

热心网友时间：2023-04-22 16:05

基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。基本概念 1. 基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。 2. 基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。 3. 丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。 4. 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了*性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源与129小鼠品系和其杂交品系。ES623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞）。建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。一旦ES克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。 2、ES 细胞的核型分析建立的ES细胞有相当的比例（30-50％）不具备正常核型，故需进行核型分析。C带技术进行核型分析：小鼠细胞有40条染色体（19对加两条性染色体）。常染色体和X染色体的中心着色很深，而Y染色体的着色很浅。 3、ES细胞的扩增一旦ES细胞系中高比例的细胞被确定有正常二倍体染色体数目，这一ES细胞需要较大量扩增和冻存。每5－6天ES细胞需经胰蛋白酶消化，以有效的低密度接种到新鲜培养基中，以保持细胞的不分化状态。60mm平皿最大细胞密度1-2×107。PMEF需6Gy的X射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞。二、打靶载体的构建打靶载体通常包括2个同源重组臂，用于指导打靶载体和染色体上的靶基因序列发生同源重组。同源重组臂上含有一个正筛选基因（neo），通过G418筛选，一个负选择标记的胸苷激酶（tk）基因。三、重组ES细胞的筛选 1. 饲养细胞的准备；2. ES细胞的准备；3. 转染ES细胞；4. 挑取ES克隆；5. 96孔板ES细胞备份与细胞冻存；6. Southern杂交，。四、嵌合体小鼠的制备 1. ES细胞的复苏；2. ES细胞的囊胚注射。注意：每天留一些ES细胞备第二天注射，注射通常持续1-2周；ES细胞注射到3.5天的小鼠囊胚，每只囊胚可注射10-20个ES细胞，注射的胚胎移入2.5天的假孕小鼠的子宫，每测子宫可接受9-10个囊胚。五、基因敲除小鼠的建立选择嵌合率高的雄性子鼠×野生型雌性小鼠。六、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除 Cre/loxP：来自P1噬菌体，Cre重组酶基因和loxP序列位于P1噬菌体基因组内，loxP是Cre酶的识别序列。FLP/FRT：来自酵母，FRT是FLT酶的识别序列。Cre（FLP）重组酶有删除/整合、倒位、转位等功能。基本策略是通过类似于基因敲除的方法将两个loxP位点同向引入倒要删除的基因片段两侧。建立条件性基因敲除需要分三步进行：1、通过同源重组的方法在待测删除片断的两侧引入同向的loxP位点（此步同ES细胞的打靶，只是载体不同），用Cre的瞬时表达载体转染ES细胞克隆，在Cre酶下发生DNA重排。2、构建一个在特定组织和发育阶段表达Cre酶的转基因小鼠。 3、将前两步获得的小鼠杂交，在子代小鼠转筛选特定组织中基因敲除的小鼠。七、基因敲入基因敲入：用一个设计好的基因片段来取代基因组中的特定片段和将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定片段中，这一技术也是建立在Cre－loxP系统基础上。基因敲入有两条途径删除选择标记基因：第一条途径是引入loxP位点的同源重组后，引入Cre基因瞬时表达载体，在ES细胞内瞬时表达Cre，删除两个loxP位点之间的序列，然后用该ES细胞建立相应的小鼠品系。第二条途径是先引入loxP位点的ES细胞建立一个小鼠品系，与一种Cre转基因小鼠品系杂交，最后建立基因敲入的小鼠品系。八、大规模ES细胞突变库的建立在ES细胞中利用基因捕获方法建立随机突变的ES细胞库是目前广受瞩目的研究计划。基因捕获（gene trap）技术有很多形式，在建立ES细胞突变库中最常用有两种：启动子捕获和3‘poly A信号捕获。启动子捕获：将不带启动子的筛选基因（LacZ、neo）和完整的polyA信号序列组成打靶载体，在筛选基因前可放一个RNA剪接受体，将载体转染ES细胞，进行随机插入ES细胞染色体。如果筛选基因恰好插入内源基因启动子下游，并在ES细胞中表达，那么筛选基因就可被转录，通过抗性筛选。因插入导致基因的失活，相当于进行了基因打靶过程，可以实现高通量的基因突变库，获得大量插入靶点明确的ES细胞克隆。 3‘端加尾信号捕获：利用一个缺失polyA信号的选择基因，置于广泛表达的启动子下游，同时在筛选基因下游放置RNA剪接的共体序列，构建打靶载体，利用该打靶载体转染ES细胞后，如果筛选基因恰好位于某加尾信号上游，那么筛选基因在转录时可以利用内源基因的polyA信号补上polyA序列，使得筛选基因的倒翻译。筛选具有抗性的ES细胞克隆就能富集这些插入事件。