肝癌细胞的培养
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发布时间：2022-09-09 08:36
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时间：2024-07-06 04:40
SMMC-7721细胞系是于1977年建立，材料取自一名50岁男性原发性肝细胞癌HCC患者的手术切除标本进行体外培养而得。其生物学特性如下: 细胞系生长较迅速稳定，在原代细胞开始传代阶段增殖缓慢，以后趋于稳定而迅速生长；细胞形态为上皮样；贴壁生长；细胞的亚微结构形态符合癌细胞的一般特征；甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)免疫荧光染色呈阳性；LDH同工酶谱的变化与肝癌细胞的一般特征一致；免疫缺陷小鼠体内可成瘤率高，动物异种后瘤结节经病理切片检查，其组织形态和原手术切除标本类似。
Bel-7402于1974年建立，来源于一位53岁男性肝癌患者的手术切除标本，属于HCC。生物学特性如下: 细胞增长迅速而恒定，6-7 d可传代1次；细胞形态以多边形上皮样占绝大多数；贴壁生长；细胞染色体中有一大而长的近端着丝点染色体，出现频率高，是本株细胞的标记染色体；AFP免疫荧光反应阳性；LDH、G6PD、TAT等酶代谢及细胞的超微结构基本上保持临床人体肝癌的特性；异种接种后成瘤率高，3-4d可成瘤，瘤块组织学病理与临床HCC相近。
该细胞系由上海医科大学中山医院建立, 将一名我国39岁男性HCC患者的肝右叶转移病灶的手术切除标本接种于裸鼠肝内建造出人肝癌裸鼠转移模型(LCI-D20)而得。已证实, 经过再次分离得到的MHCC97H、MHCC97L及HCCLM33种细胞株，依据它们的转移特点，虽来源同一父系，但具有异质性，即具有不同的转移潜能。
MHCC97人肝癌细胞系于1998年从裸鼠人肝癌转移模型(LCI-D20)体外传代培养获得，该细胞系符合一般人恶性肿瘤的病理学和遗传学特征，细胞呈上皮样，贴壁生长，血清HBsAg、AFP高表达，成瘤率高且优先转移的靶器官是肺，肺转移率100%，故证实该细胞系为高转移特性的人肝癌细胞系。
2001年，研究者从MHCC97细胞系中发现并分离出不同转移潜能的2个细胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺转移率100%，后者40%；从生长速度上，前者细胞倍增时间较后者短；穿透人工基底膜能力前者较后者大；前者均较后者活力强、代谢旺。传代至20代后，两种形态学特征及生长速度方面均较稳定。之后又从MHCC97-H裸鼠接种后成功得到更高转移潜能的HCCLM3细胞系。
1979年，从阿根廷一名15岁高加索男孩的原发性肝胚细胞瘤中分离出并建立, 该细胞系呈上皮样; 贴壁抱团生长; 生长较快, 传代周期为1-2d; 低转移; 裸鼠中成瘤率较差;AFP阳性; HBsAg阴性, 然而目前尚未证明该细胞中有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因组; 但通过实验已证实, 该细胞系分化程度较高, 细胞里代谢酶的生物转化特性较完整, 不需加入外源性活化系统。在药物作用相关研究中代谢酶保持稳定, 不会因传代次数增多而有所改变, 所含有的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞同源, 因此, 常被用于体外肝细胞代谢或遗传毒性试验方面的理想细胞系. 其中, HepG2.2.15是目前应用较为广泛的细胞株, 它是HepG2的衍生物是体外筛选抗HBV药物的良好模型, 并用于抗HBV新药开发的体外研究工具。
Hep3B分离自8岁美国黑人男童的肝癌组织. 细胞形态跟HepG2类似, 呈上皮细胞, 电镜下观察胞浆里面很多粗大的黑颗粒, 同样喜抱团贴壁生长; 其在裸鼠中能致瘤, 但基本不转移. HBV阳性, 这与HepG2不同, 这株细胞整合了完整的HBV基因组，可用于HBV感染后发展致癌相关研究。
该细胞系于1982年从一名患有肝癌的57岁日本男性肝癌组织标本上培养而得。该细胞AFP阳性，高度分化, 细胞呈上皮样, 贴壁生长. 特点是HBV阴性, 而具有丙型肝炎病毒(hepatitisC virus, HCV)易感性，故可用于HCV与肝癌的关系的研究. 除了用于研究致癌性, 还用于基因表达的调节机制、新陈代谢及VLDL的分泌等. 此细胞系的特别之处如下: 可用于生产重组蛋白如促红细胞生成素; 在蛋白质生物学方面用于研究在肝细胞内复制的登革病毒; 广泛用于异种移植动物模型.
PLC/PRF/5人肝癌亚历山大细胞于1976年建系, 细胞来自一位患有原发性HCC的莫桑比克男性患者的标本; 为上皮样贴壁生长; AFP阳性, 不产生白蛋白; 分泌ad亚型的HBsAg而不产生HBcAg或HBeAg和Dane颗粒, 却可维持HAV的繁殖; 该细胞可能含有全部HBV基因组, 同工酶谱及核型与人类同源;裸鼠异种移植可致瘤. 此细胞系因其产生HBsAg的物理化学和免疫化学特性跟HBV携带者血清中HBsAg相似, 因此, 可被用来研究HBV体外病毒及其与原发性肝癌的关联, 抗HBV疫苗所需的HBsAg颗粒的制备及抗病毒药物的制备等方面。
首先，在选择实验对象的比较上，人肝癌细胞系相较于人原代肝细胞，克服了人原代肝细胞来源困难、实验难控制、存活时间短的局限，肝癌细胞系为已获得的稳定传代的细胞，具有来源方便、操作简单、条件可控和可重复等优点，是用于肝癌疾病相关研究的理想对象。
其次，肝癌细胞系均选择来源于确诊肝癌患者的病理组织，具有与肝癌患者体内相似的遗传基因组，其发生发展机制、功能蛋白表达、病毒复制能力、侵袭转移功能及抗药性等，具有与人类亲源体极其相近的特点，因此更适合应用于肝癌各领域的研究.
HepG2人肝肿瘤细胞株广泛应用于遗传毒理学及病毒 培养 等方面的研究,研究肝脏疾病发病机理及其临床应用有着重要意义。由于其与肝细胞具有相同的生物学活性，还被用于胰岛素抵抗的研究。本文对肝癌 细胞培养 的最佳条件做一简单综述。
1.HepG2细胞的复苏条件
1.1 复苏温度的选择
唐孟萱等采用下述方法进行细胞复苏：快速将所冻存细胞40℃水浴摇床60转/ min慢摇至其溶解，溶解后马上转入 37 ℃水浴箱，手工慢摇 恒温 2～3min复苏 ,复苏后 800 转/ min 离心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛 血清 DMEM 培养基 ,混匀后加入细胞培养板 ,每孔 1 ml，5%CO2温箱 37℃培养。唐孟萱等将上述方法与细胞专著所述方法相比较，传统 37 ℃水浴方法复苏后细胞存活率为 68.4%，先40℃溶解后37℃恒温方法复苏后细胞存活率为85.7%。证明其所用方法优于传统方法。
1.2 复苏用培养基的选择
钟志宏等使用培养基培养基RPMI-1640和DMEM两种培养基对HepG2细胞进行培养，结果发现，用DMEM培养基培养的细胞结果在接种密度为1×104/cm2、血清含量为15%时，经6h培养后细胞开始贴壁，12h后大部分细胞贴壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例传代。
而用RPMI-1640培养基培养的细胞在接种密度为1×104/cm2、血清含量为20%时，时，经6h培养后细胞贴壁不明显，但12h后部分细胞贴壁，24h后亦大部分细胞贴壁，且增值速度相对较慢，5天后可以按1:3的比例进行传代。以上结果说明，使用DMEM培养基既可以节省血清，细胞贴壁所用时间短、增殖速度快，并且传代细胞培养也使用DMEM培养基，使用DMEM培养基进行复苏，避免了配制不同培养基所带来的麻烦，因此在HepG2细胞复苏中推荐使用DMEM培养基。
1.3 复苏时的接种密度
甘起霓等研究发现当接种密度为1×104/cm2，血清含量为20%时, 细胞24 后大部分贴壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例传代；当接种密度大于1×104/ cm2和（或）血清含量少于20%时, 细胞表现为贴壁困难, 出现进行性退化; 当接种密度小于1×104/ cm2 血清含量为20%时, 细胞24h后大部分贴壁, 但增殖速度明显减慢, 约7d后才可按1:3比例传代。
2.消化酶及消化时间的选择
唐孟萱等研究发现， EDTA +胰酶的消化能力太强，消化时间不好把握，传代消化后细胞死亡较多；EDTA消化能力太弱，消化时间太长且不易将细胞消化完全;用PBS将细胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆盖细胞约30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min， 显微镜 下可观察到细胞消化适度。钟志宏等将待传代细胞不用PBS洗涤和用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后分别用0.25%的胰 蛋白酶 溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液进行消化（消化液用量为盖满瓶底），观察时间为30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟。结果发现：不用PBS洗涤的细胞分别用上述两种酶消化，10分钟后细胞仍然消化不完全。
用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后的细胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化时，分别经3分钟、1分钟和0.5分钟能完全消化好细胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液进行消化时，完全消化好细胞约需3分钟、1.5分钟、1分钟。二者的结果相符。根据上述结果可知，在进行HepG2细胞的消化时，先用pH7.2的PBS洗涤三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分钟效果比较好。费洪新[5]等人则推荐使用如下方法进行消化：果明显，对细胞的影响小。一般适宜的消化方法是：用1×PBS将细胞洗涤2次 再加入适量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的体积比混合）覆盖细胞约20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的体积比混合）。
3.培养基中血清浓度的选择
由于人肝癌 细胞株生长缓慢，恶性程度较高，对于血清的要求比较严格，其培养时所需要胎牛血清的浓度要比一般的肿瘤细胞高一些。些经验，费洪新等人认为在含15%胎牛血清的DMEM培养基中HepG2人肝癌细胞生长迅速。钟志宏、王爽等人的实验结果也支持上述结果。甘起霓则认为血清含量为20%时, HepG2细胞贴壁后增殖速度最快。当HepG2细胞增殖数代后, 待其状态稳定时, 可将血清含量逐渐降至10%。唐孟萱[1]等人则认为12%的血清浓度足以满足HepG2细胞的生长。
4.双抗浓度的选择
王爽等通过正交实验优选发现，双抗浓度为0.5%时传代效果较好，条件易于控制，且细胞能顺利生长。
5.培养基pH条件的选择
钟志宏等人实验发现复苏细胞和传代细胞在pH6.8-7.4、5%CO2条件下培养，其贴壁和增值速度无明显变化。
而无CO2条件下培养时，复苏细胞在不同pH值条件下均表现为培养液逐渐变碱性，细胞不能贴壁，且逐渐缩小，退化；传代细胞在不同pH值条件下培养，其培养液逐渐变酸性,当pH值﹥7.0时，经24h培养后，细胞基本贴壁，但增值缓慢，经48h培养后大部分细胞已伸出伪足，细胞数量明显增多；当pH值﹤7.0时，细胞贴壁困难，经72h培养后，细胞缩小、呈退化趋势。王爽等通过正交实验优选发现，pH7.2时传代效果较好，条件易于控制，且细胞能顺利生长，与上述结果相符。
6.细胞传代条件的选择
王爽等通过正交实验对HepG2细胞的传代条件进行优选，他推荐在细胞汇合度达95%-1000%时进行传代。
唐孟萱等人的研究结果表明HepG2 细胞生长至汇合度50%～95%时是对数生长期,死细胞相对较少;而当汇合度达到 100%时 ,生长趋于平台期 ,死细胞数开始增加;特别是汇合度 100%以后再继续培养,死细胞数明显增加而活细胞数减少。据此可确定 HepG2 细胞培养最佳的传代时期是在汇合度 95%～100%之间。二者的实验结果相符，推荐在汇合度在95%-100%时进行细胞传代。
