cre flox系统初识
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发布时间：2022-09-07 16:32
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时间：2024-12-05 04:14
哈哈哈，因为之前一直在临床和实验室像小陀螺一样，感觉自己什么都是一团糟，什么都不懂。现在开始重新做人，看到什么都去仔细了解一下，就从组会上老听但是并不懂的cre呀，loxp呀，reporter鼠呀的，感觉好难，去了解了一下，都是些什么鬼。
之前一点都不了解这个东西，没有接触过基因重组小鼠实验。就去看了下相关文章，里面有涉及到这个基因重组技术，跟朋友那才了解，获悉Cre-Lox 在动物试验里是很常用的技术。整理的内容就是目前自己理解的，哪里不对请纠正，含泪万分感谢。也希望给不了解它的人提供一些有帮助的信息。
Cre最早是微生物里发现的基因，它可以编码Cre recombinase，Cre重组酶可以识别特异性序列，这个序列被称作Loxp序列，有34bp长。Cre重组酶会识别到Loxp序列并且修改Loxp之前的基因/序列(取决于Loxp的方向，建议维基百科看详细介绍，此处重点)，经常用这个技术knockout gene。
一般这个基因重组技术会用到杂交。打个比方，父亲老鼠里的某特异性基因A(我们感兴趣的基因，比如细胞态/组织特异表达的基因)里，在胚胎时期被修改并插入Cre基因序列，这样以来它所有细胞的基因组里这个特异基因中都带有了Cre基因序列，Cre基因的表达和翻译受到该特异性基因A的启动子影响，也就是说如果一个细胞里A基因被激活/可以转录的，那么Cre基因也同样被激活/可以转录的。
但是，还没完，Cre转录之后目的是编码蛋白啊，一种叫做Cre重组酶的东西，还需要FLox啊。通常Loxp会在母亲鼠里面，目的是切掉两个Loxp中间的序列或者基因，起到一定的生物学作用。用到的也是我看的这篇文章提到的，胚胎细胞开始在母亲鼠的Rosa26区域/基因的两个外显子之间转入Loxp序列(据说都这么干)，Loxp中间是一个STOP基因，这段序列可以阻止下游的基因被转录，类似转录停止位点，还没完，还是在Rosa26基因的两个外显子之间紧随Loxp-stop-Loxp之后，还有一些reporter gene被加入里，报告基因一般包括LacZ，GFP，YFP，etc(如果不了解这些报告基因，建议维基百科看详细介绍，此处重点)。所以说在通常情况下母亲鼠里全体细胞里Rosa26基因都是转录到STOP序列后停止了。还有一点要提的就是,Rosa26这个基因在老鼠里几乎是所有细胞/组织都会转录的(启动子是工作的)但是这个基因没什么大用，所以大家在这里面各种修改添加都不会影响到小鼠的健康问题。那么，现在有了A基因-Cre父亲鼠和Rosa26-Loxp-reporter母亲鼠，接下来就是让他们别闲着造小鼠。他们的孩子就一般标记成A-Cre::RLacZ/A-Cre::RGFP/A-Cre::RYFP/ etc，“::”代表的意思是？没错“杂交”，所以这个杂交小鼠一般是研究的目的样品。 因为在这一代出生的小鼠身上同时包含了两处基因被修饰的地方，一个是A基因，一个是Rosa26区域/基因。目的基因A一般应该是特异性的，只在某些细胞或者某些组织特异表达的(一些marker基因)，那么在这些A基因表达的细胞/组织里Cre也跟着表达了，因为Cre严格受到A基因的启动子*，随后Cre的mRNA编码成Cre重组酶出去工作了(细胞主要的功能体现者是蛋白质)。随着Cre重组酶的表达接下来会切断Rosa26两个外显子内，两个Loxp序列之间的STOP基因，所以呢，没错后面的Repoter gene开始转录了，大便通畅的赶脚。所以我们可以通过检测Repoter基因产物可以间接的检测到这些细胞，比如组织染色，in situ hybridization(ISH)染色，荧光检测，etc。
这时候可能会问到，那直接在特异基因后添加个repoter gene不就可以轻松搞定了吗？何必这么麻烦，弄来弄去还需要嘿咻嘿咻。重点在这里，不论是加在A基因后的Cre也好，或是直接加个repoter gene也好，他们都会直接/即时的受到A基因的活性调节，非常同步；基因重组小鼠的情况则不然，Cre重组酶表达后会不可逆转的切掉该细胞的STOP基因，repoter gene会持续表达下去，也就是即使后来Cre基因不转录了，你依然会看到repoter gene在该细胞表达，顿时感觉想出这个技术的人太牛了，所以这个基因重组技术通常可以被用于追踪勘测一些细胞态转化分化，“即使你变了我也认得你”。
Cre/LoxP系统来源于F1噬菌体，是非常经典有效的基因编辑技术。
Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA 重组。
Cre就是一个重组酶，可以识别LoxP位点。
Incible Cre:These constructs require the addition of an exogenous ligand (e.g. tamoxifen) to activate Cre. One advantage of this system is tight temporal regulation.
（1）诱导Cre：这些结构需要添加外源性配体(如他莫昔芬)来激活Cre。这个系统的一个优点是严格的时间管理--这一个是我们最常用到的！
Promoter-regulated Cre:The promoter region defines the areas in which Cre will be expressed. Cre may be expressed globally under a broadly active promoter like CAG, or expressed only in a subset of cells under a more specific promoter (e.g. Rho-Cre is expressed in the retina).
（2）启动子*的Cre：启动子区域定义了Cre表达的区域。Cre可能在广泛活跃的启动子(如CAG)下全局表达，也可能仅在特定启动子下的细胞子集中表达(如Rho-Cre在视网膜中表达)。
Fluorescent Cre:The fusion of Cre to a fluorescent reporter enables visualization of Cre expression.
（3）Cre与荧光报告基因的融合使Cre表达可以可视化--可以直接看见荧光哦！
Optimized Cre:Codon-optimized Cre (iCre) is expressed at higher levels in mice than P1 bacteriophage Cre, facilitating high rates of Cre-driven recombination. CREM (or Cre-M) has been engineered to contain an intron, preventing Cre expression when cloning in E. coli. This alteration enables the generation of a single vector containing Cre and a floxed construct (unmodified Cre will cause recombination in E. coli, deleting the floxed portion of a construct ring the cloning process). VCre and SCre are alternative Cre recombinases that recognize specific mutant loxP sites, VloxP and SloxP sites respectively.
（4）嗯......好复杂
Split Cre:Cre recombinase is split in half into N and C terminal Cre fragments (NCre and CCre, respectively) and placed under the control of different promoters. Expression of both N and CCre in the same cell type allows for recombination of LoxP flanked DNA sequences.
（5）将Cre重组酶分为N和C端Cre片段(分别为NCre和CCre)，置于不同启动子的控制下。N和CCre在同一细胞类型中的表达允许LoxP侧边DNA序列的重组。
loxP是一段长34bp的DNA序列，是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。
参考资料：
https://info.abmgood.com/blog/introction-to-cre-lox
https://www.addgene.org/cre-lox/
这些LoxP结构允许crec*基因表达，Cre可激活或抑制基因表达，这取决于其结构。常见构造类型包括：
（1）依赖于Cre的基因表达：在感兴趣的基因上游，在任何一侧（通常称为“lox-stop-lox”或“LSL”盒）放置一个带有loxP位点的停止密码子，可以防止Cre缺失时的基因表达。在Cre存在的情况下，停止密码子被切除，基因表达继续进行。
为啥要突然提到AAVS1？是因为以上提到的LoxP我们已经知道，应该把LoxP放在目的基因的内含子中（中间是外显子，最好是功能区外显子）。而Cre想要稳定表达怎么办呢？这时候就要借助AAVS1位点的作用了。已有试剂盒可以做到AAVS1 位点（又称为 PPP1R2C 位点）位于人类基因组第19号染色体，是一个经过验证、能确保转入 DNA 片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录。另外很重要的一点是在该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。
