怎么样配置培养基
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发布时间：2022-04-23 16:28
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时间：2022-07-04 07:33
你要查清楚，你要配的培养基的成分有那些，然后把要用的东西找到。在配制之前你要把装培养基的容器准备好，是用试管、平皿还是三角瓶。之后看要配的是固体培养基还是液体培养基，觉得是否放琼脂或明胶。之后找来一个大烧杯，依次把要放的物质放入，要是配的是固体培养基要把加入琼脂或明胶的培养基放在电炉上加热，待琼脂或明胶完全溶解后趁热迅速分装。之后把分装好的培养基封口，之后选择是干灭还是湿灭，等灭菌之后，配制培养基的工作就完成了。
培养基的配制与灭菌
1目的
1.1了解并掌握培养基的配制、分装方法
1.2掌握各种实验室灭菌方法及技术。
2原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
3材料
3.1器皿及材料
天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。
3.2药品试剂
蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
4流程
称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。
5步骤
5.1培养基的制备
5.1.1称量药品
根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
5.1.2溶解
用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。
5.1.3调节pH
根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。
5.1.4溶化琼脂
固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
5.1.5过滤分装
先将过滤装置安装好（图3-1）。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞， 引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
5.1.6包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
5.1.7灭菌
上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面(图3-2)，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。
5.1.8倒平板
将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板。
5.2灭菌方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
5.2.1.高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）。
5.2.1.1操作方法和注意事项如下
加水
打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。
装料、加盖
灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。
排气
打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。
升压、保压和降压
当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。
灭菌后的培养基空白培养
灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。
5.2.2干热灭菌法
通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。
干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。
5.2.2.1灭菌前的准备
玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。
5.2.2.2干燥箱灭菌
将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。
用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。
5.2.2.3火焰灭菌
直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。
6结果
6.1记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。
6.2试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。
注：(一)培养基的配制
培养基按组成成分及对这些成分了解的程度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基三类，从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类，培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于时间，本次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
1�马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）
这是植病实验室最常用的培养基(简称PSA)，主要用于植物病原真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌。
成分：马铃薯200克�
蔗 糖 10~20克�
琼 脂 17~20克�
加水至1000毫升
方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。
马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH，培养细菌则调节pH至中性，此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pH。
5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。
2�肉汁胨培养基（BPA）
这种培养基主要用于细菌的分离和培养
成分：牛肉浸膏 3克
蛋白胨 5~10克
蔗糖 10克
酵母浸膏 1克
琼脂 17~20克
加水至 1000毫升
方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调节pH至7，趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。
牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要先称好杯和棒的重量后，再开始沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。
调节培养基pH至中性的方法如下：配成1N的HCl和NaOH，并另分别稀释配成1/20 N的HCl和NaOH。取培养基2毫升，加蒸馏水7.5毫升，加指示剂溴百里酚蓝指示剂5滴，这时如培养基的测样呈*则用有刻度吸管加入1/20 N的NaOH若呈蓝色则加入1/2O N的HCl，使培养基最后呈草绿色即调节到中性，此刻所加酸或碱的毫升数的25倍即等于在1000毫升培养基中所需要加入lN 的NaOH或HCl的毫升数(注意这次是作500毫升培养基)，加蒸馏水稀释的目的防止调节过程中培养基凝固。
调节pH至中性的简便方法是用石蕊示纸。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培养基和溴百里酚蓝或其它指示剂1—2滴，根据颜色反应，在所配的培养液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取样测定，如此反复多次，达到所需求的反应为止。
5人分为一组，3、4两组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约100毫升，灭菌后摆成斜面，其余300毫升分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善存放，留待下次实验使用。
此外，1、2、3、4各组均制备15管试管装和2瓶三角瓶装的无菌水。
(二)培养基的灭菌
为了得到某种病原物的纯培养，配好的培养基必须经过灭菌才能使用，灭菌是指用物理或化学方法完全杀死器物表面及其内部的所有微生物，灭菌与消毒的概念不同，消毒则是指消灭器物或植物组织表面的某些微生物(能常称杂菌)，而不是消灭所有的微生物。
灭菌的方法很多，植病实验室常用的有干热灭菌和高压蒸汽灭菌两种方法，一般培养皿、吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌。而培养基和实验用的土壤，则用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，具体灭菌方法和步骤如下：
1�干热灭菌法
(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁筒)，包纸时应将吸取的一端放在取时先折开的一端，以便取用时手勿触及要求灭菌的一端。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时，闭上排气孔，继续加热至一定温度后，用定温固定温度，灭菌温度一般165℃—175℃保持1小时即可。
(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。
2�高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它的原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下：
(1)关好排水阀门放入清水至标度为止，注意水量一定要加足，否则容易造成事故。
(2)将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度(不要太紧)，然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。
(3)通电加温，同时打开排气活门，排尽锅内的空气，即活门冲出的全部是蒸气时则表示彻底，此时可关闭排气活门，如果过早关闭活门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。通常当压力表指针升至5磅时，打开排气活门放气，降至零点，再关闭活门。
(4)压力表的指针上升时，锅内温度也逐渐升高，当压力表指针升至15磅时，蒸气温度相当于120℃—121℃(等于一个大气压)，此时开始计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持30分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后停止加温。
(5)稍微打开一点排气活门，使锅内蒸气缓慢排除，然后逐渐开大活门，气压徐徐下降，注意勿使排气过快，否则会使锅内的培养基沸腾而冲脱或沾湿棉花塞，但排气太慢又使培养基在锅内，受高温处理时间过长，这样对培养基也是不利的。一般从排气到打开锅盖以10分钟左右为好。
(6)当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时，打开锅盖取出培养基，如需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上，上面盖上报纸以免落灰尘，冷却后便可收起。� (7)最后将高压灭菌器内的剩余水排出。
(8)抽取上述灭菌的培养基，放入25℃温箱中，48小时后不见杂菌生出，便证明培养基已达到灭菌目的，可以使用。
此外，有些培养基在经高压灭菌后，其营养成分容易分解而失去使用价值，此时可采用间歇蒸气灭菌法，即将放入高压灭菌器内，加热至100℃，保持1小时，每天灭菌一次，连续进行三次，即可达到灭菌的目的，又不至使营养物质分解。
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时间：2022-07-04 08:51
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时间：2022-07-04 10:26
