荧光光度法原理

发布网友 发布时间：2022-04-29 21:00

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热心网友 时间：2023-10-09 03:21

方法提要

水样用高氯酸-硫酸-钼酸钠消化，再用盐酸将硒(Ⅵ)还原为硒(Ⅳ)。在酸性条件下，硒(Ⅳ)与2，3-二氨基萘反应生成有绿色荧光的4，5-苯并苤硒脑，用环己烷萃取，在激发波长376nm，发射波长520nm下，进行荧光光度法测定。

本法适用于海水、天然水中总硒的测定，若试样不经酸处理，可直接测定四价硒的含量。方法检出限为0.2μg/L。

仪器和装置

荧光分光光度计。

电动振荡器。

试剂

盐酸。

高氯酸。

硫酸。

去硒硫酸量取200mLH₂SO₄在搅拌下，徐徐加入200mL水中，加30mLHBr，混匀，置沙浴上加热至冒白烟。

氢溴酸。

氢氧化铵。

环己烷若有荧光杂质需重蒸馏提纯，用过的环己烷重蒸馏后可再使用。

EDTA溶液(0.2mol/L)称取37gEDTA二钠盐于250mL烧杯中，加适量水，加热溶解，冷却后稀释至500mL。

盐酸羟胺溶液(100g/L)称取10gNH₂OH·HCl于100mL烧杯中，用水溶解后，并稀释至100mL。

EDTA-盐酸羟胺混合溶液量取100mL0.2mol/LEDTA、10mL100g/L盐酸羟胺溶液，加水稀释至1000mL。

2，3-二氨基萘(DAN)溶液(1g/L)称取400mgDAN于500mL烧杯中，加400mL0.1mol/LHCl溶解，然后转入1000mL锥形分液漏斗中(漏斗颈部塞有脱脂棉)，在振荡器上振荡15min使其全部溶解。加入80mL环己烷再振荡5min，静置分层后，收集水相，弃去有机相，如此反复纯化数次，直至有机相的荧光强度降到接近纯环己烷的荧光强度为止。将纯化后的DAN溶液贮存于棕色瓶中，加入环己烷使其覆盖液面约1cm厚，置于冰箱中保存，有效期一个月。

高氯酸-硫酸-钼酸钠混合溶液称取7.5g钼酸钠(Na₂MoO₄·7H₂O)溶于150mL水中，加入200mLHClO₄和150mL去硒H₂SO₄，混匀。贮存于500mL试剂瓶中。

硒标准储备溶液ρ(Se)=0.40mg/mL称取0.1405g二氧化硒(SeO₂，纯度99.9%)于50mL烧杯中，用适量水溶解后，移入250mL容量瓶中，加0.1mol/LHCl至标线，混匀。

硒标准溶液ρ(Se)=0.100μg/mL用0.1mol/LHCl逐级稀释硒标准储备溶液配制。

甲酚红指示液(0.4g/L)称取40mg甲酚红于100mL烧杯中，加少量水及2滴(1+1)NH₄OH溶解，加水至100mL。

校准曲线

取6个50mL烧杯，分别加入0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL和4.00mL硒标准溶液，加水稀释至约10mL，混匀。

加5mL混合酸溶液，在沙浴中加热消化至冒浓白烟，至溶液变黄(约2h)。取下冷却至室温，溶液恢复为无色，用水释至约10mL。加5mLHCl，将烧杯放在沙浴表面加热至溶液变黄为止。取下冷却至室温。

将溶液移到50mL比色管中，用少量水洗净烧杯，洗液并入比色管中。加5mLEDTA-盐酸羟胺混合溶液，4～5滴(0.4g/L)甲酚红指示液，用(1+1)NH₄OH或0.1mol/LHCl调节pH为1.5～2.0(粉橙色)，加3.0mLDAN溶液，摇匀，置沸水浴中加热5min取下冷却到室温。将溶液移入60mL分液漏斗中，用少量水洗涤比色管，洗液并入分液漏斗中。加3.0mL环己烷，振摇4min，分层后弃去水相。

将环己烷层从分液漏斗口到入1cm比色皿中，在荧光分光光度计上，以376nm为激发波长，520nm为发射波长，环己烷为参比，测定硒的荧光强度I_i。以荧光强度I_i-I₀(标准空白)为纵坐标，相应硒含量(μg)为横坐标绘制校准曲线。

分析步骤

量取5.00～50.0mL海水样，于50mL烧杯中加5mL混合酸溶液，在沙浴中加热消化至冒浓白烟，至溶液变黄(约2h)。以下按制定校准曲线步骤测定荧光强度I_w。同时测定分析空白荧光强度I_b。

由I_w-I_b查校准曲线得硒量，海水样硒浓度的计算参见式(78.30)。

注意事项

1)配制DAN溶液时应在暗处进行。

2)在沸水浴上加热5min后，用冷水冷却的时间控制在10min内。否则结果会稍偏低。

3)甲酚红指示剂有两个变色范围，当pH2～3时由红变黄，pH7.2～8.8时由黄变红。本方法中调节pH为1.5～2.0时至粉橙色，pH<1.5为桃红色。因此调pH时要注意颜色变化，必要时可用精密pH试剂确证。

4)玻璃器皿用HNO₃溶液浸洗2～3d，洗净后使用。

5)试样制备。海水样品用玻璃或塑料采样器采集，水样应及时经0.45μm滤膜(滤膜预先在0.5mol/LHCl中浸泡12h，用纯水冲洗至中性，密封待用)过滤，并用HNO₃酸化至pH<2，贮存于聚乙烯塑料瓶或硬质玻璃瓶中，再以聚乙烯薄膜袋包封样品瓶。

6)水样体积的校正。在量取测定水样之前向水样加入的试剂溶液超过1%体积时，按式(78.31)进行体积校正。

7)水样中硒含量低时，可增加水样体积至50mL，对测定无影响。

热心网友 时间：2023-10-09 03:21

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