什么是HAT?他和单克隆抗体技术有什么关系?

发布网友发布时间：2022-04-27 03:35

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热心网友时间：2022-06-25 13:52

HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（de novo pathway）和中间合成途径（salvage pa-thway）。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。
单克隆抗体技术中也要选择有用的杂种细胞（即能产生抗体，又能无限传代）
单克隆抗体的制备
（以ST13单抗为例）

一、ST13蛋白制备
1．将ST13cDNA 与GST融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-2重组，转化E.coli INV?F’菌；
2．表达产物经Glutathione Sepharose 4B亲和层析得到ST13- GST融合蛋白；
3．以凝血酶切获得纯化的ST13蛋白。

二、小鼠免疫
共作3次基础免疫，每周1次。
首次免疫，将ST13- GST融合蛋白以福氏完全佐剂乳化，第2、3次免疫以福氏不完全佐剂乳化，每鼠0?2ml腹腔注射（含ST13- GST融合蛋白25ug）。
1个月后作加强免疫，每鼠0?1ml尾静脉注射（含ST13- GST融合蛋白50ug），3天后取脾细胞。

三、细胞融合、筛选及克隆化培养
1．按常规取免疫小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，在50%聚乙二醇作用下融合，以含20%小牛血清的HAT选择性培养基培养；
2．ELISA间接法筛选能分泌抗体的杂交瘤细胞孔，选取OD值最大的阳性孔细胞，予以有限稀释克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100%；
3.将最后选出的阳性单克隆细胞将扩大培养，接种BALB/c小鼠腹腔，诱生腹水。

四、ELISA间接法检测抗体
1.以pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将纯化的ST13蛋白稀释至1.56 ug/ml，每孔0.1 ml包被酶标板，4℃过夜；
2.以pH 7.4的0.02 mol/L Tris-HCl-Tween20洗板，封闭并洗涤后，每孔加0.1 ml待检细胞培养上清（同时设阳性、阴性和空白对照），37℃温育 1小时，洗涤；
3.每孔加0.1 ml 1：800稀释的羊抗鼠IgG/HRP，同上温育、洗涤；
4.加邻苯二胺底物显色20分钟，以2 mol/LH2SO4终止反应，490nm测定光密度。

五、Western-Blot
1．取样品作10%SDS-PAGE；
2．电转移至PVDF膜，封闭；
3．加细胞培养上清，4?C过夜后洗膜；
4.加1：500稀释的羊抗鼠IgG/HRP作用 2小时，漂洗；
5.ECL检测。

六、单克隆抗体Ig亚类鉴定

七、单克隆抗体的纯化
饱和硫酸铵法

热心网友时间：2022-06-25 13:53

我还以为是Hardness Assurance Test 硬度保证测试呐。。。