分子克隆的基本方法
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发布时间：2022-04-29 04:37
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时间：2023-09-16 17:34
基因库的建造
特异基因的筛选
核酸序列测定
一、基因克隆的基本方法
一个典型的基因克隆实验，主要有以下操作和结果：
（1）包括有目的基因在内的DN*断插入另一个DNA分子（克隆载体，通常是环状的），形成重组DNA分子。
（2）重组DNA分子通过转化或其他类似的方法被导入受体细胞。大肠杆菌是使用较多的受体细胞。
（3）在受体细胞中，克隆载体指导重组DNA分子复制，产生许多完全相同的拷贝。
（4）当受体细胞*时，重组DNA分子的拷贝进入子细胞，克隆载体的复制将在子细胞中继续。
（5）大量*的受体细胞形成克隆：一个细胞群体，其中每个细胞都含有许多重组DNA分子的拷贝。
显而易见，基因克隆是一个比较直观而简单的操作程序。它之所以具有非常重要的生物学意义，是因为这一技术可以为我们提供一个纯粹的基因标本。通常，一个基因总是和细胞里其他基因同在。基因克隆技术诞生之前，我们根本无法纯化单个基因，这意味着我们只能对基因群、而不是特定基因的结构与功能进行研究和开发利用。
１、重组DNA分子的构建
构建重组DNA分子是基因克隆实验的第一步，亦即，把环状的载体在指定部位切断，然后把含目的基因的DNA分子插入其中，再将两者连接起来。这一过程需要两种DNA操作酶：*性内切酶（restriction endonucleases）和连接酶（ligases）。
*性内切酶能够识别DNA分子上的特定核苷酸序列，并在该处特异性切断DNA分子。例如，PvuI（细菌Proteus vulgaris分离）只识别和切断6核苷酸序列CGATCG；从相同细菌分离的PvuII，却只识别并切断CAGCTG。许多*性内切酶的识别位点是6个核苷酸，但是，也有识别4个或5个、甚至8个核苷酸顺序的*性内切酶。此外，有些*性内切酶的识别顺序可能不是唯一的，例如，HinfI可以识别并切断GAATC、GATTC，GAGTC和GACTC。因此，通常也将HinfI的识别位点记为GANTC，N代表A、T、G和C中的任意一种核苷酸。
经*性内切酶处理后的DNA分子断端有两种：平端和粘端，它们的性质对基因克隆的实验设计有重要影响。其中，具有不同识别位点的*性内切酶可以产生相同的粘端。例如，BglII（AGATCT）和BamHI（GGATCC）产生与Sau3A相同的GATC粘端。显然，经上述三种酶处理的DNA分子片断之间均可以在相应的断端形成互补双链。
DNA分子片断通过粘端形成的碱基互补并不能使之相互连接，后一过程需要连接酶的催化作用。所有生物细胞中都产生连接酶，但是，基因克隆中最常用的是T4噬菌体的连接酶。连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键。由于平端不能使DN*断保持相互接近的位置，因而，和粘端相比，连接酶对平端DNA分子之间连接反应的催化效率较差。
２、克隆载体及其主要功能
