灰树花母种制备技术有哪些?

发布网友发布时间：2022-04-27 11:36

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热心网友时间：2023-09-15 10:36

在灰树花生产中，菌种制作通常分为二级，即母种和原种。母种也叫一级种，由于菌丝生长在试管的斜面上，所以又称为试管种或斜面种。为了保证质量，防止退化，母种的转接扩管不超过3次，转扩次数增多，产量有下降的趋势。对长期保藏的菌株，复壮后须经出菇试验，方可用于大规模生产或销售。一般生产者都是引进母种，经扩繁后用于制备原种。

（一）母种培养基配方母种培养基常用琼脂做凝固剂，琼脂又名洋菜或冻粉，从海藻石花菜或其他红藻中提取加工而成，为透明、无味、粉条或粉末状。琼脂的主要化学成分是多聚半乳糖的硫酸脂，包括D-葡萄糖醛酸、L-半乳糖、D-半乳糖、3，6-脱水-L-半乳糖和丙酮酸等。干琼脂一般含水16%，灰分4.4%，氧化钙1.15%，氧化镁0.77%，氮0.4%。琼脂化学结构稳定，不易被菌丝分解利用，在培养基中仅起凝固剂的作用，其在96℃时融化成液体，冷却到45℃以下即重新凝固。由于用琼脂配制的固体培养基清晰透明，便于观察菌丝的形态，故成为常规斜面域平板培养基不可缺少的材料。其用量因使用季节、目的和琼脂本身质量的不同而异。一般在冬天加1.5%～1.8%，夏天为2%；分离菌种时加2.5%，生产时加1.5%～2%。用量过多，培养基较硬，保水性好，不易干燥，但成本高。须指出，即使是最纯品的琼脂，也仍然会含有微量的含氮化合物及残存无机盐，因此在进行营养要求精确的实验中，最好不用琼脂。对于生产而言，要求培养基营养丰富，菌丝健旺，因此采用各种加富培养基。

食用菌母种培养基常用马铃薯（土豆）补充维生素。鲜薯含水分75%，粗蛋白2.1%，粗脂肪0.1%，粗纤维0.7%，可溶性碳水化合物（主要是淀粉）21%，粗灰分1.1%。配制食用菌的母种培养基时，去皮切块水煮后用滤汁。

常用的母种培养基如下：

（1）马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基（PDA）去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。这种培养基养分较少，菌丝不会徒长，常用于菌种分离、提纯及转管保存菌种。

（2）去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2.5克，硫酸镁0.5克，蛋白胨3克，维生素B120毫克，琼脂20克，水1000毫升。

（3）去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，板栗木屑100克，水1000毫升。

（4）高粱粉50克，葡萄糖10克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。

（5）平菇200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2.5克，硫酸镁0.5克，蛋白胨3克，琼脂20克，水1000毫升。

（二）试管斜面的制备

1.配制培养基选择优质马铃薯，去皮（挖去芽眼），切成薄片，称取200克，加水1000毫升放入小铝锅内煮沸20～30分钟，趁热用3层纱布过滤后取滤液，并用热水补充到1000毫升，倒回小铝锅内。加琼脂继续加热，并用玻璃棒搅拌至琼脂全部溶化后，加葡萄糖，再补水至1000毫升。

2.分装试管母种培养基一般用试管为容器，常用的规格为2种，18毫米×18毫米及20毫米×20毫米，培养基装量为10～15毫升，为试管长度的1/4～1/5，培养基不可沾附试管内壁，如有沾附物必须擦试干净。

3.做棉塞取适量棉花制作棉塞，棉塞要做的圆滑硬实，棉塞总长3～4厘米。标准的棉塞应是塞头较大，不易变形，入管的部分占塞总长的2/3，露在管外的部分则为1/3（不少于1厘米）。棉塞的大小、松紧要与试管口配套，塞入试管的棉塞要紧贴管壁，不留缝隙。过紧妨碍空气流通，也不便操作；过松则达不到滤菌目的，且棉塞易掉入或脱离试管。松紧度以提起棉塞而试管不脱落，拔出棉塞有轻微的声音为适宜。

4.灭菌将6～8支试管捆成1把，上面用牛皮纸或双层报纸包住，用皮筋或线绳扎紧，以防棉塞受潮。直立放在高压锅内灭菌。加热灭菌时，排尽锅内冷气，当温度升到121℃（压力1.0千克/厘米2）时，维持30～40分钟后停止加热，待指针回到零点，先打开锅盖的1/5，利用余热烘干棉塞，等到无直冲蒸气时，再打开锅盖，取出试管。

5.摆斜面趁热将试管一端垫放到木条上，使其成一定角度的斜面，一般斜面长度达试管全长的1/2为宜。气温低时，覆盖保温，以防冷凝水过多，待完全凝固后，收取备用。

6.灭菌效果检查随机抽取5支试管，在25℃下进行空白培养3～5天后，检查斜面上有无杂菌，如果发现有杂菌，说明灭菌不彻底，要废弃或重新灭菌，无杂菌出现，即可供接种用。

（三）接种与培养

1.灭菌接种前先将接种用具、培养基以及菌种等放到接种箱（或接种室）内，然后按每立方米用高锰酸钾5克，40%甲醛溶液10毫升的量进行熏蒸消毒30分钟，如有紫外线灭菌灯，同时开启照射30分钟后进行接种。

2.接种接种时试管口不要离开酒精灯火焰旁的无菌区，灼烧一下接种钩并待其冷却，将斜面上的菌苔纵横划切成米粒大的小块（图3-3），深度以稍带培养基为适，然后再取种块迅速放到待接试管斜面的中心位置，抽出接种钩后，再把试管口烘烧一下，棉塞过火后迅速塞好。如此反复接种，一般每支母种可转接30～50支试管。

3.培养将接种后的试管放入25℃的培养箱或培养室进行恒温培养，灰树花需要12～15天的培养，菌丝才能长满试管斜面。在培养过程中要随时检查，挑除有杂菌感染或有异常现象的试管，以保证母种的质量。