小鼠肝细胞的分离需要注意哪些问题
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发布时间：2022-04-29 17:05
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时间：2023-10-21 17:38
小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
注意事项：
肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。
每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含许许多多复杂的细微结构：如细胞核、细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、微粒体及饮液泡等组成。
扩展资料：
小鼠肝细胞生成
血细胞来源于骨髓的造血多能干细胞。干细胞除具有增殖能力外，在一定的情况下尚能从骨髓造血组织中迁出，随着血流到达髓外组织形成造血细胞小结，百称为集落形成单位。
血细胞的增殖是以*的方式进行的，但只有幼稚细胞才有*能力，一旦发育成熟到一定阶段后，增殖便告停止。
每一个小结由许多同类型分化的细胞组成，这些细胞是由一个干细胞*分化而来。干细胞虽有自身复制和分化为各种血细胞的能力，但在一般情况下，并不处于增殖状态，而是处于休止的G0期。
参考资料来源：百度百科-肝细胞
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时间：2023-10-21 17:38
小鼠日龄：6周龄以上适合两步灌流法，6周龄以下适合组织块剪碎法。
两步灌流法：
1.小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。
2.沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
3.前灌流液灌流结束后，灌流5ml缓冲液后灌流后灌流液30ml，3-5ml/min。
4.取下肝脏，使用基础培养基冲洗肝脏表面1次。剪碎肝脏，加入20ml基础培养基，轻轻吹打，先后过滤80目、200目细胞筛，收集滤液，600rpm，离心5min。
5.收集沉淀，加入20ml基础培养基重悬细胞，600rpm，离心5min。
6.收集沉淀，加入适量完全培养基+10%FBS重悬细胞，台盼蓝染色计数，以5×105/孔转移细胞入6孔细胞培养板生长。
7.隔天换液，使用完全培养基+5%FBS培养细胞，隔天换液。
组织块剪碎法：
1.断头处死成年小鼠，充分放血后迅速无菌取出肝脏组织，置于缓冲液中；
2.首先将肝组织剪成5mm边长的组织块，使用缓冲液洗涤2-3遍，然后进一步将肝组织剪碎成1mm3的组织小块，使用缓冲液冲洗直至上清澄清；
3.组织块转移至50ml离心管内，加入10ml消化液，37%，静置消化1h，间隔15min摇动1次；
4.消化完全后使用巴氏滴管反复吹打消化产物30次，消化物分别过80目、200目细胞筛，收集滤液；
5.1000rpm，室温离心8min，收集细胞，使用基础培养基重悬细胞；
6.600rpm，离心5min，重复离心纯化2次，细胞经台盼蓝染色，计数，按1x106/25cm2的细胞数分瓶，使用完全培养基+20%FBS进行培养。
7.18h后换液，以后每天换液。
试剂配方：
前灌流液：
含0.02%EDTA，50U/ml肝素钠的无Ca2+，Mg2+的HBSS
缓冲液：
含Ca2+，Mg2+的HBSS
后灌流液：
含0.1%Ⅳ型胶原酶的HBSS（含Ca2+，Mg2+）
基础培养基：
高糖DMEM+10%FBS
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时间：2023-10-21 17:39
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时间：2023-10-21 17:38
小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
注意事项：
肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。
每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含许许多多复杂的细微结构：如细胞核、细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、微粒体及饮液泡等组成。
扩展资料：
小鼠肝细胞生成
血细胞来源于骨髓的造血多能干细胞。干细胞除具有增殖能力外，在一定的情况下尚能从骨髓造血组织中迁出，随着血流到达髓外组织形成造血细胞小结，百称为集落形成单位。
血细胞的增殖是以*的方式进行的，但只有幼稚细胞才有*能力，一旦发育成熟到一定阶段后，增殖便告停止。
每一个小结由许多同类型分化的细胞组成，这些细胞是由一个干细胞*分化而来。干细胞虽有自身复制和分化为各种血细胞的能力，但在一般情况下，并不处于增殖状态，而是处于休止的G0期。
参考资料来源：百度百科-肝细胞
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时间：2023-10-21 17:38
小鼠日龄：6周龄以上适合两步灌流法，6周龄以下适合组织块剪碎法。
两步灌流法：
1.小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。
2.沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
3.前灌流液灌流结束后，灌流5ml缓冲液后灌流后灌流液30ml，3-5ml/min。
4.取下肝脏，使用基础培养基冲洗肝脏表面1次。剪碎肝脏，加入20ml基础培养基，轻轻吹打，先后过滤80目、200目细胞筛，收集滤液，600rpm，离心5min。
5.收集沉淀，加入20ml基础培养基重悬细胞，600rpm，离心5min。
6.收集沉淀，加入适量完全培养基+10%FBS重悬细胞，台盼蓝染色计数，以5×105/孔转移细胞入6孔细胞培养板生长。
7.隔天换液，使用完全培养基+5%FBS培养细胞，隔天换液。
组织块剪碎法：
1.断头处死成年小鼠，充分放血后迅速无菌取出肝脏组织，置于缓冲液中；
2.首先将肝组织剪成5mm边长的组织块，使用缓冲液洗涤2-3遍，然后进一步将肝组织剪碎成1mm3的组织小块，使用缓冲液冲洗直至上清澄清；
3.组织块转移至50ml离心管内，加入10ml消化液，37%，静置消化1h，间隔15min摇动1次；
4.消化完全后使用巴氏滴管反复吹打消化产物30次，消化物分别过80目、200目细胞筛，收集滤液；
5.1000rpm，室温离心8min，收集细胞，使用基础培养基重悬细胞；
6.600rpm，离心5min，重复离心纯化2次，细胞经台盼蓝染色，计数，按1x106/25cm2的细胞数分瓶，使用完全培养基+20%FBS进行培养。
7.18h后换液，以后每天换液。
试剂配方：
前灌流液：
含0.02%EDTA，50U/ml肝素钠的无Ca2+，Mg2+的HBSS
缓冲液：
含Ca2+，Mg2+的HBSS
后灌流液：
含0.1%Ⅳ型胶原酶的HBSS（含Ca2+，Mg2+）
基础培养基：
高糖DMEM+10%FBS
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小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
注意事项：
肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。
每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含许许多多复杂的细微结构：如细胞核、细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、微粒体及饮液泡等组成。
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血细胞来源于骨髓的造血多能干细胞。干细胞除具有增殖能力外，在一定的情况下尚能从骨髓造血组织中迁出，随着血流到达髓外组织形成造血细胞小结，百称为集落形成单位。
血细胞的增殖是以*的方式进行的，但只有幼稚细胞才有*能力，一旦发育成熟到一定阶段后，增殖便告停止。
每一个小结由许多同类型分化的细胞组成，这些细胞是由一个干细胞*分化而来。干细胞虽有自身复制和分化为各种血细胞的能力，但在一般情况下，并不处于增殖状态，而是处于休止的G0期。
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小鼠日龄：6周龄以上适合两步灌流法，6周龄以下适合组织块剪碎法。
两步灌流法：
1.小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。
2.沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
3.前灌流液灌流结束后，灌流5ml缓冲液后灌流后灌流液30ml，3-5ml/min。
4.取下肝脏，使用基础培养基冲洗肝脏表面1次。剪碎肝脏，加入20ml基础培养基，轻轻吹打，先后过滤80目、200目细胞筛，收集滤液，600rpm，离心5min。
5.收集沉淀，加入20ml基础培养基重悬细胞，600rpm，离心5min。
6.收集沉淀，加入适量完全培养基+10%FBS重悬细胞，台盼蓝染色计数，以5×105/孔转移细胞入6孔细胞培养板生长。
7.隔天换液，使用完全培养基+5%FBS培养细胞，隔天换液。
组织块剪碎法：
1.断头处死成年小鼠，充分放血后迅速无菌取出肝脏组织，置于缓冲液中；
2.首先将肝组织剪成5mm边长的组织块，使用缓冲液洗涤2-3遍，然后进一步将肝组织剪碎成1mm3的组织小块，使用缓冲液冲洗直至上清澄清；
3.组织块转移至50ml离心管内，加入10ml消化液，37%，静置消化1h，间隔15min摇动1次；
4.消化完全后使用巴氏滴管反复吹打消化产物30次，消化物分别过80目、200目细胞筛，收集滤液；
5.1000rpm，室温离心8min，收集细胞，使用基础培养基重悬细胞；
6.600rpm，离心5min，重复离心纯化2次，细胞经台盼蓝染色，计数，按1x106/25cm2的细胞数分瓶，使用完全培养基+20%FBS进行培养。
7.18h后换液，以后每天换液。
试剂配方：
前灌流液：
含0.02%EDTA，50U/ml肝素钠的无Ca2+，Mg2+的HBSS
缓冲液：
含Ca2+，Mg2+的HBSS
后灌流液：
含0.1%Ⅳ型胶原酶的HBSS（含Ca2+，Mg2+）
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小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
注意事项：
肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。
每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含许许多多复杂的细微结构：如细胞核、细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、微粒体及饮液泡等组成。
扩展资料：
小鼠肝细胞生成
血细胞来源于骨髓的造血多能干细胞。干细胞除具有增殖能力外，在一定的情况下尚能从骨髓造血组织中迁出，随着血流到达髓外组织形成造血细胞小结，百称为集落形成单位。
血细胞的增殖是以*的方式进行的，但只有幼稚细胞才有*能力，一旦发育成熟到一定阶段后，增殖便告停止。
每一个小结由许多同类型分化的细胞组成，这些细胞是由一个干细胞*分化而来。干细胞虽有自身复制和分化为各种血细胞的能力，但在一般情况下，并不处于增殖状态，而是处于休止的G0期。
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小鼠日龄：6周龄以上适合两步灌流法，6周龄以下适合组织块剪碎法。
两步灌流法：
1.小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。
2.沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
3.前灌流液灌流结束后，灌流5ml缓冲液后灌流后灌流液30ml，3-5ml/min。
4.取下肝脏，使用基础培养基冲洗肝脏表面1次。剪碎肝脏，加入20ml基础培养基，轻轻吹打，先后过滤80目、200目细胞筛，收集滤液，600rpm，离心5min。
5.收集沉淀，加入20ml基础培养基重悬细胞，600rpm，离心5min。
6.收集沉淀，加入适量完全培养基+10%FBS重悬细胞，台盼蓝染色计数，以5×105/孔转移细胞入6孔细胞培养板生长。
7.隔天换液，使用完全培养基+5%FBS培养细胞，隔天换液。
组织块剪碎法：
1.断头处死成年小鼠，充分放血后迅速无菌取出肝脏组织，置于缓冲液中；
2.首先将肝组织剪成5mm边长的组织块，使用缓冲液洗涤2-3遍，然后进一步将肝组织剪碎成1mm3的组织小块，使用缓冲液冲洗直至上清澄清；
3.组织块转移至50ml离心管内，加入10ml消化液，37%，静置消化1h，间隔15min摇动1次；
4.消化完全后使用巴氏滴管反复吹打消化产物30次，消化物分别过80目、200目细胞筛，收集滤液；
5.1000rpm，室温离心8min，收集细胞，使用基础培养基重悬细胞；
6.600rpm，离心5min，重复离心纯化2次，细胞经台盼蓝染色，计数，按1x106/25cm2的细胞数分瓶，使用完全培养基+20%FBS进行培养。
7.18h后换液，以后每天换液。
试剂配方：
前灌流液：
含0.02%EDTA，50U/ml肝素钠的无Ca2+，Mg2+的HBSS
缓冲液：
含Ca2+，Mg2+的HBSS
后灌流液：
含0.1%Ⅳ型胶原酶的HBSS（含Ca2+，Mg2+）
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小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
注意事项：
肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。
每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含许许多多复杂的细微结构：如细胞核、细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、微粒体及饮液泡等组成。
扩展资料：
小鼠肝细胞生成
血细胞来源于骨髓的造血多能干细胞。干细胞除具有增殖能力外，在一定的情况下尚能从骨髓造血组织中迁出，随着血流到达髓外组织形成造血细胞小结，百称为集落形成单位。
血细胞的增殖是以*的方式进行的，但只有幼稚细胞才有*能力，一旦发育成熟到一定阶段后，增殖便告停止。
每一个小结由许多同类型分化的细胞组成，这些细胞是由一个干细胞*分化而来。干细胞虽有自身复制和分化为各种血细胞的能力，但在一般情况下，并不处于增殖状态，而是处于休止的G0期。
参考资料来源：百度百科-肝细胞
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时间：2023-10-21 17:38
小鼠日龄：6周龄以上适合两步灌流法，6周龄以下适合组织块剪碎法。
两步灌流法：
1.小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。
2.沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
3.前灌流液灌流结束后，灌流5ml缓冲液后灌流后灌流液30ml，3-5ml/min。
4.取下肝脏，使用基础培养基冲洗肝脏表面1次。剪碎肝脏，加入20ml基础培养基，轻轻吹打，先后过滤80目、200目细胞筛，收集滤液，600rpm，离心5min。
5.收集沉淀，加入20ml基础培养基重悬细胞，600rpm，离心5min。
6.收集沉淀，加入适量完全培养基+10%FBS重悬细胞，台盼蓝染色计数，以5×105/孔转移细胞入6孔细胞培养板生长。
7.隔天换液，使用完全培养基+5%FBS培养细胞，隔天换液。
组织块剪碎法：
1.断头处死成年小鼠，充分放血后迅速无菌取出肝脏组织，置于缓冲液中；
2.首先将肝组织剪成5mm边长的组织块，使用缓冲液洗涤2-3遍，然后进一步将肝组织剪碎成1mm3的组织小块，使用缓冲液冲洗直至上清澄清；
3.组织块转移至50ml离心管内，加入10ml消化液，37%，静置消化1h，间隔15min摇动1次；
4.消化完全后使用巴氏滴管反复吹打消化产物30次，消化物分别过80目、200目细胞筛，收集滤液；
5.1000rpm，室温离心8min，收集细胞，使用基础培养基重悬细胞；
6.600rpm，离心5min，重复离心纯化2次，细胞经台盼蓝染色，计数，按1x106/25cm2的细胞数分瓶，使用完全培养基+20%FBS进行培养。
7.18h后换液，以后每天换液。
试剂配方：
前灌流液：
含0.02%EDTA，50U/ml肝素钠的无Ca2+，Mg2+的HBSS
缓冲液：
含Ca2+，Mg2+的HBSS
后灌流液：
含0.1%Ⅳ型胶原酶的HBSS（含Ca2+，Mg2+）
基础培养基：
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