如何做环状RNA的功能验证
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发布时间：2022-04-21 23:00
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时间：2023-07-07 13:55
环状RNA：
动物体内的环状RNA（Circular RNA,CircRNA）是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。
环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的*，把
这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生
物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。
重要作用及研究意义：
在对circRNA 结构和功能研究的基础上，有研究人员发现它们在动脉粥样硬化，神经系统紊乱，糖尿病和
肿瘤等疾病发生过程中，发挥非常重要的作用。对环状RNA研究具有重要的意义:
1）circRNA独具的竞争性内源（ceRNA）特征可为药物开发提供新的思路；
2）circRNA的组织特异性和稳定性有可能使circRNA成为一种良好的生物标志物；
3) circRNA 的研究为生命的进化研究提供新的方向。
功能特征：
对于环状RNA的具体功能尚未有明确研究报道，目前只有几种假定的说法:
1）circRNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA ，抑制其功能；
2) circRNA通过碱基互补配对直接*其他RNA水平；
3）circRNA能与蛋白质结合, 抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或*蛋白质的活性；
4）circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。
研究策略：
一、环状RNA确定与筛选
1）环状RNA生物信息学预测
2) 环状RNA高通量测序
3）环状RNA表达丰度检测
4）FISH 检测环状RNA的亚细胞定位
5）NorthernBlot 检测环化RNA的存在
二、环状RNA的功能研究
1）环状RNA的过表达实验（Gain of function）
2）环状RNA功能缺失实验（Loss of function ）
三、环状RNA的表达*
1）环状RNA与miRNA互作结合生物预测及实验验证
2）环状RNA与miRNA相互作用预测研究
3）环状RNA与蛋白相互作用研究
热心网友
时间：2023-07-07 13:55
1. circRNA定量验证
circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物，称之为convergent primer，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1.1）。而对于circRNA，尤其外显子环化circRNA，除backsplice junction位点处不同于linear RNA之外，body区与linearRNA是一致的。因此，验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer，称之为divergent primer（如图1.1），而且设计的PCR proct的长度越短越好，可以增强backsplice junction位点处扩增效率。
图1.1 convergent primer vs divergent primer
为增强circRNA的验证效率，起始模版需满足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。
验证策略：对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增，电泳检测PCR proct大小（如图1.2）。
图1.2 circRNA引物扩增结果
2. circRNA Northern blot验证
Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法，需围绕circRNA设计探针序列，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节。对于circRNA探针设计，我们建议以下两点：1. 对于外显子环化circRNA，建议探针尽可能跨backsplice junction位点；2.对内含子环化circRNA，可围绕内含子区域设计探针。
验证策略：对3 free RNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证。
3. circRNA过表达
circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，已有多篇文章报道circRNA成环机制，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对，称之为Alu结构（如图2）。
图2 circRNA侧翼结构特征
基于circRNA侧翼Alu序列特征，PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列，随后依据对应*性内切酶位点进行酶切，进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本，定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。
过表达策略：1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效率更佳；2. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。
4. circRNA敲除
circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA，对于内含子环化circRNA，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰。Divergent primer验证circRNA敲除倍数。
敲除策略：
1. 外显子环化circRNA，针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA，如图3所示；
2. 内含子环化circRNA，除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外，也可针对内含子区域序列设计siRNA。
3. 每个siRNA设计对应的对照，backsplice junction位点一端互补配对，另一端错配，如图3所示。
