细菌原生质融合的资料!急求!

发布网友发布时间：2022-05-14 05:49

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热心网友时间：2022-07-15 01:33

一、目的要求
了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。

二、基本原理
原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的*。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。
(一) 原生质体融合的优点
(1) 克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2) 基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组 (包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二) 原生质体融合步骤
(1) 选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2) 制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3) 促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4) 原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5) 检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6) 融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
(三) 原生质体再生率和融合率计算

三、实验材料
(一) 菌种
枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro-
(二) 培养基(见附录)
(1) 完全培养基(CM，液体)；
(2) 完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂；
(3) 基本培养基(MM)；
(4) 补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min；
(5) 再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。
(6) 酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。
(三) 缓冲液
(1) 0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融合剂
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六) 溶菌酶液
酶粉酶活为4000 u/g，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用。
(七)器皿
培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比色计、细菌过滤器